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2 de dezembro de 2013

Nanomedicina aplicada ao diagnóstico de trombose

Biomarcadores sintéticos podem detectar trombose em estágios iniciais através de exames não invasivos.

A análise de urina tem uma vasta história clínica como ferramenta para vigilância da saúde e é um componente integral de um exame médico. Mais de 100 testes podem ser realizados através da urina para indicar condições tão diversas como a gravidez, diabetes, doenças renais e distúrbios metabólicos. Recentemente, a descoberta de analitos urinários de grande raio hidrodinâmico, que imaginava-se estarem presentes principalmente no sangue, ampliou o repertório de diagnósticos possíveis para incluir biomarcadores urinários contra doenças como o câncer de mama e do cérebro.

Pesquisadores das áreas de engenharia química, engenharia biomédica, engenharia elétrica e ciência da computação do MIT e da universidade de Minnesota uniram esforços para criar um método de detecção de coágulos de sangue através de um exame de urina. A formação de coágulos obstrutivos, ou trombose, é uma condição de risco de vida associada com doenças tais como a aterosclerose e acidente vascular cerebral. Os pesquisadores utilizaram o fato de que uma proteína, chamada trombina, desempenha um papel crítico na formação destes coágulos para desenvolver biomarcadores sintéticos que podem ser manipulados para detectar doenças vasculares. Foram desenvolvidas nanopartículas que vasculham o sistema circulatório à procura de trombos e, em resposta à atividade da trombina, liberam peptídeos repórteres que são acumulados na urina.

Inspiradas na fisiologia do sistema renal, uma classe de nanopartículas sensíveis à protease chamada de biomarcadores sintéticos já havia sido desenvolvida nos últimos anos. Estas nanopartículas liberam peptídeos repórteres na circulação em resposta a uma atividade desregulada da protease nos locais de doença. Estes peptídeos concentram-se na urina e podem então ser monitorados de forma não invasiva com um simples exame de urina. Este método permite, por exemplo, detectar tumores em estados muito mais precoces em comparação ao que seria possível através da detecção de biomarcadores naturais secretados pelo câncer.

Os biomarcadores sintéticos para a trombose foram criados a partir da modificação da superfície de nanoworms (NW) de óxido de ferro com peptídeos repórter cliváveis por trombina e detectáveis por ELISA. Os pesquisadores escolheram utilizar estes nanoworms devido ao seu grande diâmetro hidrodinâmico, aproximadamente 40 nm, que impede que os peptídeos conjugados em sua superfície sejam filtrados diretamente para a urina. Para construir um repórter sintético, os pesquisadores modificaram um peptídeo resistente à protease, que foi selecionado por sua alta eficiência na filtração renal. Estes peptídeos foram estendidos com glicina e ligados a uma cisteína C-terminal para permitir o acoplamento com os NWs através de uma via química sulfidrilo.

Indução de embolia pulmonar para experimentação in vivo

Os pesquisadores investigaram a capacidade de detecção de trombose dos biomarcadores sintéticos através da administração intravenosa de tromboplastina em camundongos. A tromboplastina desencadeia uma cascata de coagulação que sintetiza a condição clínica de embolia pulmonar (EP). Para quantificar a formação de EP, também foi injetado o fibrinogênio precursor dos coágulos marcado com um fluoróforo de infravermelho próximo. Deste modo, a formação de coágulos pôde ser quantificada pela análise de fluorescência de órgãos completos. Assim foi possível controlar com precisão a carga total de coágulos num modelo que se assemelha à patologia clínica de trombose venosa.

Detecção de embolia pulmonar a partir da urina

Diferentemente de outros sensores feitos com nanopartículas, que funcionam produzindo um sinal localizado, os NWs desenvolvidos sofrem a atividade de protease e liberam peptídeos repórteres nos locais de formação de trombos, que são filtrados e detectados remotamente a partir da analise da urina. Os pesquisadores monitoraram a clivagem dos peptídeos e o tráfego dos fragmentos clivados através de NWs conjugados com substratos fluorescentes. Nos camundongos com EP foi observado um aumento de 1,8 vezes na fluorescência nos pulmões e 2,5 vezes nos rins em comparação com animais saudáveis. A partir destes resultados, os cientistas puderam concluir que os peptídeos eram clivados nos pulmões, acumulados nos rins e então excretados através da urina.

Para o imunoensaio, os pesquisadores coletaram a urina dos camundongos com EP induzida. Ela foi então aplicada a placas ELISA de 96 poços, pré-revestidas com anticorpos de captura. Um teste ELISA convencional detecta um analito alvo através do complexo formado pela interação anticorpo-antígeno. Como previsto a partir das especificidades dos anticorpos utilizados, os pesquisadores observaram alteração na cor somente dos poços que continham urina dos ratos com EP induzida, ou seja, aqueles onde havia a formação complexo anticorpo/analito.

O sistema desenvolvido é facilmente escalonável e o resultado pode até ser detectado por outros métodos, como por exemplo testes baseados em papel realizados nos pontos de atendimento (hospitais, postos de saúde). Os nanoworms foram escolhidos pois permitem uma fácil adaptação clínica para testes em humanos. NWs já mostraram ser bem toleradas por ratos, e o FDA (Food and Drug Administration, nos EUA) já aprovou formulações semelhantes de nanopartículas de óxido de ferro para serem utilizados em pacientes humanos. Esses substratos de trombina também podem ser ligados a outras nanopartículas de longa circulação, tais como dextranos ou lipossomos, para evitar a filtração do peptídeo pelo sistema renal até que ocorra a clivagem por proteases.

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Detecção de trombose em ratos utilizando nanopartículas de óxido de ferro.

Os pesquisadores agora pretendem trabalhar com modelos clínicos específicos, tais como a trombose venosa profunda (TVP). Segundo eles, este seria um importante passo para determinar o tipo de coágulos que o método desenvolvido pode detectar. O trabalho desenvolvido certamente amplia o escopo dos nanomedicamentos que podem ser usados para o monitoramento não invasivo de coágulos obstrutivos e trará melhorias significativas na qualidade de vida de pacientes que hoje dependem de técnicas invasivas para realizar tais testes. e

Artigo escrito com base em:

Anne Trafton, MIT News Office, 15/10/2013
Kevin Y. Lin et. al, ACS Nano, 2013, 7 (10), pp 9001–9009

Agradecemos ao Dr. Leonardo Foti, do Instituto de Biologia Molecular do Paraná, pelo trabalho de revisão técnica do artigo.

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